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dnf漫游:免疫沉淀(IP)的常見問題及解答

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1. 用于一般免染的抗體是否都可以用作免疫沉淀實驗?

答:抗體的性質對免疫沉淀實驗影響很大??固宀煌?,和抗原以及Protein GProtein A的結合能力也就不同。所以一般免染能結合的抗體未必能用于IP反應。 一般來說,多抗是沉淀反應最好的選擇。另外,純化的單抗、腹水和雜交瘤上清液也可用于免疫沉淀。

2. 為什么溶解抗原的緩沖液中要加入一定量的蛋白酶抑制劑?

答:從活性細胞裂解出來的樣品中,往往含有一定量的蛋白酶。為防止預檢測蛋白的分解,修飾,溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑,并且在低溫下進行實驗。

3. 溶解抗原的緩沖液的配制需要注意什么?

答:多數的抗原是細胞構成的蛋白,特別是骨架蛋白,緩沖液必須要使其溶解。為此,必須使用含有強表面活性劑的緩沖液,盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結合。另一面,如用弱表面活性劑溶解細胞,就不能充分溶解細胞蛋白。即便溶解也產生與其它的蛋白結合的結果,抗原決定族被封閉,影響與抗體的結合。

4. 免疫沉淀實驗應如何把握抗體和緩沖液的比例?

答:每次沉淀實驗之前,考慮抗體/緩沖液的比例十分重要??固騫倬筒荒薌斐隹乖?,過多則就不能沉降在beads上,殘存在上清;緩沖劑太少則不能溶解抗原,過多則抗原被稀釋。具體比例視具體情況而定。

5. 免疫沉淀應該如何配制細胞裂解液?

答:適當的細胞裂解液的選擇取決于所要研究蛋白的特性。TritonX-100,NP40是非離子界面活性劑,作用溫和;DOC(sodium de-oxycholate),SDS是離子性的強活性劑。所以裂解液的配制時所用去污劑的種類和濃度以及鹽濃度等條件需實驗者進行優化。注意如果忘記加TritonX-100,只加DOCSDS,可能使抗體完全失去活性。

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