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dnf代码:實驗專欄丨擬南芥幼苗蛋白免疫共沉淀實驗步驟!

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一、 擬南芥幼苗蛋白免疫共沉淀為例詳解實驗步驟:
1、 擬南芥幼苗在液氮中充分研磨
2、 將粉沫轉入到預先加入了3倍體積的細胞IP裂解緩沖液(含蛋白酶抑制劑)小燒杯中 , 冰上輕輕攪拌,讓其在冰上融化,后轉入離心管中,4℃,13000rpm離心20min,上清轉移至新管
3、 加入1μg相應的抗體和10-50 μl protein A/G-beads, 輕輕轉動4℃孵育1h
4、 4℃,4000rpm離心5min , 將蛋白抗體磁珠復合物離心至管底,棄上清
5、 用裂解緩沖液清洗兩次,棄去上清,最后一次上清一定要盡量去干凈
6、 加入45ulLSDS loading Buffer,沸水中煮5min , 冷卻到室溫后離心,上清液進行SDS-PAGE,WesternBloting及下游實驗檢測。


二、注意事項:

1、 樣品處理的質量決定抗原抗體反應中抗原的質量,需要控制所有操作在冰上或4℃;
2、 細胞裂解采用溫和的裂解條件,不能破壞細胞內存在的所有蛋白質-蛋白質相互作用,細胞裂解液中要加各種酶抑制劑,防止蛋白降解。多采用非離子變性劑(NP40或Triton X-100)。針對不同的實驗目的和蛋白質特性選擇不同的裂解液。
3、 實驗時需要使用對照抗體包括陰性和陽性,陰性對照一般是同種屬的IgG,陽性對照可以選用已知的細胞內某種蛋白抗體。
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