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dnf新鬼剑士职业介绍:Trizol法提取RNA教程

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一. 實驗原理


Trizol內含異硫氰酸胍能迅速破碎細胞,同時使核蛋白復合體中的蛋白變性并釋放出核酸;由于釋放出的DNA和RNA在特定pH值下的溶解度不同,且分別位于中間相和水相,從而使DNA和RNA得到分離;取出水相后,通過有機溶劑(氯仿)抽提及異丙醇沉淀,可得到純凈RNA。


二. 操作步驟


1.通過離心來沉淀細胞后,棄上清,用移液管加TRIZOL試劑反復吹打來裂解細胞至均一通亮的液態后,將勻漿樣品在15—30°C 條件下孵育5 分鐘以使核蛋白體完全分解。(每5—10×106的動物細胞,植物或酵母菌細胞或每1×107 細菌加1ml的TRIZOL。在加入TRIZOL前應避免洗滌細胞因為那樣會增加mRNA降解的可能性。) 


2.分離階段 


每1 mlTRIZOL 加0.2 ml 氯仿。蓋緊樣品管蓋,用手用力搖晃試管15 秒并將其在30°C 下孵育2—3 分鐘。在2—8°C 下以不超過12,000×g 的離心力高速冷凍離心15 分鐘。離心后混合物分成三層:下層紅色的苯酚-氯仿層,中間層,上層無色的水樣層。RNA 無一例外地存在于水樣層當中。水樣層的容量大約為所加TRIZOL 容量的60% 


3.RNA的沉淀 


將水樣層轉移到一干凈的試管中,通過將水樣層和異丙醇混合來沉淀RNA。最初均化時的每1 mlTRIZOL 對應0.5 ml 異丙醇。將混合的樣品在 15—30°C 條件下孵育10 分鐘并在2—8°C 下以不超過12,000×g 的離心力高速冷凍離心10 分鐘。RNA沉淀在離心前通常不可見,形成一膠狀片狀沉淀附著于試管壁和管底。 


4.RNA的洗脫 


移去上層懸液。用75%的乙醇洗滌RNA 沉淀一次,每1 ml 的TRIZOL 至少加1 ml 的75%乙醇。旋渦振蕩混合樣品并在2—8°C 下以不超過7,500×g的離心力高速冷凍離心5 分鐘。


5.RNA的再溶解 


在操作的最后,簡單干燥RNA沉淀。尤為重要的是,不能讓RNA沉淀完全干燥那樣會極大地降低它的可溶性。部分溶解的RNA樣品其A260/280 比值< 1.6。用移液管尖分幾次移取無RNA酶的水或0.5% SDS溶液來溶解RNA,并在55—60°C下孵育10 分鐘。


三. 注意事項


1.樣品量和 Trizol 的加入量一定要按以上的比例,不能隨意增加樣品量或減少 Trizol 量,否則會使內源性 RNase 的抑制不完全,導致 RNA 降解。  


2.整個過程要及時更換手套,戴雙層口罩,并在操作區開啟酒精燈。


3.RNA一定要貯存到-80℃冰箱,在-20℃保存時間很短。


4.配制的溶液應用滅菌處理的DEPC水。


5.玻璃器皿可以在150°C 的烘箱中烘烤4 小時。塑料器皿可以在0.5 M NaOH 中浸泡10 分鐘,用水徹底漂洗干凈后高壓滅菌備用。

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